研究生知识库

生物监测技术被广泛地用于大气污染研究；特别在偏远地区或进行大尺度范围监测时，其能作为一种相对经济的替代技术。氮含量及氮同位素分析技术促进了应用指示生物对区域大气氮沉降特征的研究；苔藓及维管束植物对大气氮沉降强度的响应以及对氮来源的识别，为研究城市地区大气污染及氮沉降情况提供了基础。植物游离氨基酸作为植物吸收同化氮素的初级含氮代谢分子，当植物叶片组织吸收利用大气沉降氮时，其组成特征的变化能对大气氮沉降做出灵敏的响应。本论文同时研究了苔藓和维管束植物，将植物组织氮含量、氮同位素示踪技术与组织游离氨基酸组成特征分析相结合；开展了植物氮代谢对大气氮沉降响应的初步研究。对贵阳不同地区采集的三类植物组织中的氮含量、氮同位素及游离氨基酸含量进行对比研究，探讨了植物氮代谢对区域大气氮沉降特征潜在的指示作用。本研究主要获得的一些有意义的发现和结果如下：1. 建立了25种氨基酸的液相色谱定量分析方法本文采用高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）分离测定氨基酸含量。使用柱前OPA和FMOC自动在线衍生技术，在26 min内能同时分离和检测28种氨基酸。所有氨基酸分离度良好，干扰峰很少；氨基酸洗脱保留时间变异系数（CV）平均不大于1%。七个浓度分析标准的重复性精度良好，氨基酸FLD峰面积与内标面积比值（RAA/IS）平均RSD小于3%；校正浓度除了Lys、Cy2和Orn偏大，其余氨基酸平均RDS小于4%；强荧光响应及高浓度时，氨基酸的分析精度更高。分析方法的重现性稳定，定期测定两个质控标准（22.5μM和90 μM），保留时间和RAA/IS的日内精度RSD分别小于0.3%和小于2%；日间精度RSD分别小于1.0%和5.0%。校正浓度的平均变异系数，日内和日间精度分别低于2%以及不超过3.5%。构建氨基酸含量校正方程，分析4.5μM至450 μM间的七个浓度标准溶液，最小二乘线性回归分析物与内标浓度比及峰面积比。所有氨基酸校正线的决定系数（R2）都接近1，从0.9989到0.9999。氨基酸LOD范围为0.12到6.75 μM，LOQ从0.39到 22.28 μM；平均值分别为1.3 μM和4.4 μM。除了Lys的LOD=3.44 μM，Cy2和Orn因其荧光响应相对低得多而检测限较高外，其余氨基酸LOD均低于2 μM。2. 优化了植物组织游离氨基酸提取方法对比三种提取液80%（v/v）EtOH、5%TCA（v/v）和5%TFA（v/w）对樟树和松树叶片游离氨基酸的提取结果，TCA和TFAA提取的游离氨基酸总量明显高于EtOH。提取液的极性差异及氨基酸极性不同，会造成某些氨基酸提取效率出现略微差别。TFA提取樟树和松树游离氨基酸的精度均略好于TCA和EtOH；其提取精度平均RSD分别为3.34%和1.30%，范围分别为0.19-9.98%和0.02%-4.74%。优化TFA提取流程能获得满意的游离氨基酸提取效率、洁净的提取液及干净的液相色谱峰图。樟树和松树叶片两个浓度（25和100 μM）的加标回收率很相似，大多氨基酸回收率高于90%且均不超过110%。部分氨基酸的回收率低于80%，特别是在加标量为25 μM时，色氨酸（Trp 71%）和羟脯氨酸（Hyp 67%）的回收率显著偏低。两种植物及两个加标量所有氨基酸的平均回收率为94.39%，回收率精度均值为3%。3. 植物氮含量及氮同位素指示大气氮沉降苔藓主要吸收利用大气氮素作为营养，其氮含量直接反应出大气氮的沉降强度。苔藓组织总氮含量在1.18%到 2.48%之间，平均值为1.85%。估算出贵阳地区大气氮沉降水平为8.59-33.66 kg/ha/yr，说明贵阳大气沉降依然处于很高的水平。市中心区及交通干道附近苔藓平均氮含量分别为2.21%和2.17%；城区往外15km内城郊苔藓氮含量开始降低，平均为1.63%；在远郊林地采得的苔藓样品平均氮含量降低至1.45%。结果与前人研究的贵阳市区大气氮沉降（污染）高、郊区低的普遍情况一致。同时苔藓组织的总氮含量与总碳含量存在明显的线性正相关关系。苔藓样品δ15N值均为负值，在-7.29‰到-2.03‰之间，平均值为-4.68‰。市区及近郊地区的苔藓其同位素值分别为-5.65‰、-5.81‰依然明显偏负，反映出贵阳城区整体较高的大气铵沉降。交通干道苔藓δ15N值为-3.43‰；市区及交通干道地区δ15N值较前人研究明显偏正，源于城市交通强度显著增加，释放大量δ15N值偏正的NOx。远郊及林地δ15N值为-3.35‰，随着远离城区，城市氮沉降贡献的降低，而农业铵贡献逐渐增加。苔藓δ15N值反映出贵阳大气湿沉降中的NH4+-N依然显著大于NO3--N。环境类型不同的四个地区的松树和樟树，叶片的δ15N与土壤δ15N之间存在一定的正相关关系；且松树和樟树其叶片氮N%和δ15N值分别各自正相关，说明其氮源主要是受土壤控制。植物吸收及同化氮存在歧视15N的同位素分馏作用，因此植物叶片δ15N明显小于土壤的δ15N值。樟树及松树不同地区土壤氮含量没有差异，但叶中氮含量在城区大于郊区，说明大气氮沉降对植物氮存在一定贡献。樟叶δ15N值在市区及交通干道大于郊区及远郊林地，可能是樟树主要采自公路绿化带吸收了汽车排放的NOx；而松树其土壤δ15N值在城区更高且针叶δ15N值也更高，在交通区针叶δ15N值显著大于其他地区，同时针叶与苔藓氮含量具有一定的正相关关系。结果表明即使大气氮对维管束植物直接贡献较小，叶片氮在一定程度上也能反应出城市大气沉降氮情况。4. 植物游离氨基酸组成特征反映大气氮沉降维管束植物也总游离氨基酸含量相近，均远低于苔藓组织。苔藓中主要的游离氨基酸种类为Arg、Asn、Glu、Gln、Ala及Asp，平均百分含量10%左右；樟树中为Gaba、Glu、Asp、Val和Ala，平均大于10%。松树中百分含量前几位的为Arg、Asp、Glu、Gaba及Ala。PLS-DA分析显示樟树中的Val，Ile及Gaba的百分含量明显高于苔藓样品，而Asn显著低于苔藓；Arg和Gln在苔藓和松树中明显大于樟树，且松树中Pro的百分含量明显高于其余两类样品，而Ser正好相反。冗余分析（RDA）显示苔藓中游离氨基酸的增加主要源自Arg及Asn的累积；Arg与植物N%协同变化趋势最强。维管束植物叶组织游离氨基酸的积累受土壤氮含量的影响极小；揭示出大气氮沉降对植物叶组织氨基酸组成特征的影响。樟树叶片总游离氨基酸变化主要受Asp、Gaba、Ala及Glu影响；与叶片N%变化趋势一致性最好的游离氨基酸依次有Gaba、Ala及Asp。松针总游离氨基酸变化贡献最大的为Arg，其次为Asp、Gaba和Ala；与针叶N%显著相关的是Gln，其次是Gaba、Asp及Val。同时许多游离氨基酸之间存在较好的正相关性，如芳香族氨基酸Phe与Try，支链氨基酸Thr与Val，Leu同Ile等。冗余分析将植物样品间游离氨基酸的变化与植物总氮含量的变化相结合，指示出随总氮含量增加而显著累积的氨基酸种类；为后续有关不同植物氮代谢对环境因子的响应研究提供了参考。5. 其它相关研究樟树和松树成熟叶和新叶的N%都显著大于老叶；叶片衰老时营养元素会转移出叶片被植物再吸收利用；但不同叶龄的叶片氮同位素没有显著性的差异，可能原因是氮转运出老叶时的同位素分馏作用很小。新生松针总游离氨基酸显著大于成熟叶及老叶，樟树叶片总游离氨基酸也显示出新叶>成熟叶>老叶。松针老叶Asn明显更高，可能是存在一定量的氮转运情况。新叶中的Arg含量及Gln/Glu显著高于而Gly/Ser显著低于成熟叶和老叶；源于新生组织氮营养来自植株内标氮循环转运供给，及其光合与光呼吸作用明显更低。雪松总游离氨基酸显著大于马尾松；主要是雪松中的Gaba、Asp、Ser及Glu显著性的高于马尾松。污染严重的市区雪松总游离氨基酸含量是其它地区雪松的10倍，其游离Arg占比达到80%；表明雪松游Arg对大气氮污染的灵敏响应